(一）原理
1968年以來，Margolis和Slater等人先后采用了凝膠濃度梯度電泳或稱孔徑梯度電 泳，作為分離和鑒定蛋白質(zhì)的方法，并首次將此方法用于分子量的測定。這個方法不同于 盤狀電泳，盤狀電泳是在均一濃度的聚丙烯酰胺凝膠中進行的電泳。后來R0db0rd等人 比較了線性梯度和非線性梯度電泳以及在均一膠濃度中的電泳，證明梯度凝膠電泳分辨 率更好。
在線性梯度凝膠電泳中，蛋白質(zhì)在電場中向著凝膠濃度逐漸增高的方向即孔徑逐漸減小 的方向遷移，隨著電泳的繼續(xù)進行，蛋白質(zhì)受到孔徑的阻力愈來愈大。起初，蛋白質(zhì)在凝膠中的 遷移速度主要受兩個因素的影響:一是蛋白質(zhì)本身的電荷密度，電荷密度越高，遷移速度愈快; 二是蛋白質(zhì)本身的大小，分子量愈大，遷移速度愈慢。當?shù)鞍踪|(zhì)遷移所受到的阻力大到足以完 全停止它前進時，低電荷濃度的蛋白質(zhì)將“趕上”與它大小相似，但具有較高電荷密度的蛋白 質(zhì)。因此，在梯度凝膠電泳中，蛋白質(zhì)的最終遷移位置僅取決于它本身分子的大小，而與蛋白質(zhì) 本身的電荷密度無關(guān)。梯度凝膠電泳的情況可用圖3_13-12來表示。
圖中的方格代表凝膠的孔徑，自上而下孔徑逐漸變小，形成梯度。圖中圓球分別代表 大、中、小三種不同的蛋白質(zhì)分子。A代表電泳開始前分子的分布狀況，B代表經(jīng)過長時間 電泳后的分布狀況。所有大小不同的分子進入凝膠孔徑梯度中，大、小分子分別滯留于與 其分子大小相當?shù)哪z孔徑中，不再向前移動，因而得到分離，形成三個區(qū)帶。從以上討論 看出，在梯度凝膠電泳中，分子篩效應體現(xiàn)得更為突出。由于蛋白質(zhì)的相對遷移率與其分 子量的對數(shù)在一定范圍內(nèi)成線性關(guān)系，因此通過制作標準曲線，在相同條件進行未知樣品 的電泳，便可測定出未知蛋白質(zhì)的分子量。
(二） 特點
梯度凝膠電泳與均一凝膠電泳相比有如下的優(yōu)點：
具有使樣品中各個組分濃縮的作用。在樣品太稀的情況下，可在電泳過程中分二、 三次加樣，由于大小不同的分子最終都滯留于與其相應的凝膠孔徑中而得到分離。
可提供更清晰的蛋白質(zhì)譜帶，因此能用于鑒定蛋白質(zhì)的純度。
可以在一個凝膠片上同時測定分子量范圍相差相當大的蛋白質(zhì)。例如:膠濃度為 4%〜30%梯度膠可以分辨的分子量范圍為50 000〜2 000 000。
可以直接測定天然狀態(tài)蛋白質(zhì)的分子量，不需解離為M基。這一方法可與SDS凝 膠電泳測定分子量的方法相互補充。
梯度凝膠電泳主要適宜于測定球蛋白的分子量，而對纖維蛋白將會產(chǎn)生較大的誤差。 再者，由于分子量的測定僅僅是在未知蛋白質(zhì)和標準蛋白質(zhì)到達了被限定的凝膠孔徑時 (即完全被阻止遷移時）才成立，在電泳時要求足夠高的伏特小時（一般情況下不低于 2 OOOVh)，否則將得不到預期的效果。因此，采用這一方法測定蛋白質(zhì)的分子量有一定局 限性。
(三） 操作方法
1.試劑的配制①貯液④:稱取10. 75g Tris、5. 04g硼酸、0. 93g EDTA(EDTA-2Na .2H20)，溶于蒸餾水中，檢查pH為8. 3后，定容至1 000ml。②貯液®:稱取57. 6g丙 烯酰胺和2. 4g甲撐雙丙烯酰胺，溶于貯液®中,定容至100ml，然后過濾。③貯液©:稱 取7. 68g丙烯酰胺、0.32g甲撐雙丙烯酰胺，溶于貯液®中,定容至l00ml。④貯液④:取 0. 3ml四甲基乙二胺(TEMED),溶于貯液®中，定容至100ml。⑤貯液©:稱取0. 3g過 硫酸銨，溶于貯液®中，定溶至100ml，臨用前配制。⑥電極緩沖液[0. 09mol/LTris- 0. 08mol/L 硼酸-0.0025mol/L EDTA(pH 8.4)]:稱取 10.98g Tris、4.95g 硼酸、0.938£0- 丁八咖丁八-21^.2托0)，力[|7欠溶解，定容至1001111。(2)25%乙醇。_.1%溴酚藍指示劑。 ⑨固定液:10%的磺酸水楊酸溶液。⑩染色液(0.1%考馬斯亮藍R250-25%甲醇-10%乙 酸溶液）:稱取lg考馬斯亮藍R250,溶于250ml甲醇，再加入100ml冰乙酸，用水定容至 1 000ml。⑪脫色液（25%甲醇-10%乙酸）：取250ml甲醇、100ml冰乙酸加水定容至 1 000m丨。⑫7%乙酸。⑬標準蛋白質(zhì):瑞典Pharmacia公司出品（見表3-13-13)。
表3-13-13 5種標準蛋白質(zhì)
|
蛋白質(zhì)名稱 |
分子量 |
來 |
源 |
|
甲狀腺球蛋白 ， |
669 000 |
豬甲狀腺 |
|
|
鐵蛋白 |
440 000 |
馬 |
肺 |
|
過氧化氫酶 |
232 000 |
牛 |
肝 |
|
乳酸脫氫酶 |
140 000 |
牛 |
心 |
|
血清清蛋白 |
67 000 |
牛血清 |
|
儀器的準備①電泳槽:本實驗所用的電泳槽為垂直板型電泳槽。使用前裝好，試 漏。②梯度混合器:本實驗所用的梯度混合器容積小，其直徑為1. 8cm，高5. 3cm，最大容 量為15ml。③用直徑1. 5mm〜2. 0mm的聚乙烯管將梯度混合器、蠕動泵、凝膠膜相連。
4%〜30%梯度膠的制備預先準備好配膠的全部貯液，計算出凝膠膜所需的體 積。
4%膠液的配制：貯液© :貯液④：貯液④=2 : 1 : 1(體積比），取3. 5ml貯液 ©，加1. 75ml貯液@，混合后抽氣，再取1. 75ml貯液©，單獨抽氣后將兩溶液混合。
30%膠液的配制：貯液⑥：貯液⑥：貯液© = 2: 1 : 1(體積比），取3.5ml貯液 ®，加1. 75ml貯液@，混合后抽氣，再取1. 75ml貯液©，單獨抽液后將兩液混合(注意： 貯液④要在灌入梯度混合器前臨時混合，以免膠液過早聚合）。
制備4%〜30%的梯度膠-灌膠:將7ml 4%的膠液加入貯液瓶，7ml 30%的膠液 加入混合瓶。打開電磁攪拌及梯度混合器的開關(guān)，接著起動蠕動泵，將梯度混合器中的溶 液緩緩輸入凝膠中。事先將輸液管出口由凝膠膜上口中央伸向底部，隨著凝膠膜內(nèi)液面的 升高逐漸提高輸液管，使管口始終接近液面而不伸進液體內(nèi)部�？刂屏魉僭趌ml/min〜 2ml/min，約lOmin灌膠完畢。
于梯度膠面上小心加入25%乙醇約3mm高。靜置30min后即可聚合。
待膠液聚合后，取出上面含醇的水層，取2ml 4%膠液洗梯度膠面，吸出后，再加 3ml 4%膠液于梯度膠上，于此膠液中插入樣品槽模板，使其下沿剛好接觸梯度膠面而不 要伸進膠內(nèi)。再于此膠液上小心加入2mm〜3mm高的水層，靜置，待聚合后，于室溫放置 老化半小時后方可使用。
預電泳小心取出樣品槽模板，用濾紙條吸去槽內(nèi)的水分。于兩個電極槽內(nèi)加入電 極緩沖液，接通電極槽中冷卻回流管和自來水管，然后接通電源，上槽接負極，下槽接正 極，維持電壓70V，預電泳20min。
加樣標準蛋白質(zhì)樣品的制備:將5種標準蛋白質(zhì)樣品按lmg/ml的濃度溶于含 20%蔗糖的電極緩沖液中，加入5W 0. 1%溴酚藍溶液作指示染料，混合后加入樣品槽內(nèi)。 通過指示染料在樣品槽內(nèi)的分布可以直接觀察加樣情況。
待測樣品的制備同標準蛋白質(zhì)。
在測定分子量時，待測樣品和標準樣品要在同一個凝膠片上進行電泳。
電泳接通電源，將電壓調(diào)至70V，電泳15min后樣品緩緩進入膠內(nèi)（30min后染料可跑 出膠片）。
接通并起動蠕動泵，開始使上、下兩電極槽中電極液回流。
將電壓升高到150V，維持恒定電壓，電泳15h〜16h。電泳至少要2 OOOVh，若冷 卻條件好，可升高電壓，縮短電泳時間。
固定、染色、脫色
固定：電泳結(jié)束后，取出凝膠片，置培養(yǎng)皿內(nèi)，用固定液浸泡30min。
染色:將固定過的膠片用染色液浸泡過夜。
脫色:可用以下兩種方法脫色：
電泳脫色：將染過的膠片夾在兩片塑料紗之間，垂直放在裝滿7%乙酸的電泳槽 內(nèi)，電極位于塑料紗兩側(cè)，維持電壓24V，電泳45min。
擴散脫色:將膠片浸于脫色液內(nèi)，每隔2h換1次脫色液，直到膠片出現(xiàn)無色透明清 晰的譜帶。若同時采用低于50‘C的水浴加溫，可縮短脫色時間。
分子量的測定
標準曲線的制作:以凝膠片的前沿或遷移距離最大的標準蛋白質(zhì)為參考點，計算 每種標準蛋白質(zhì)的相對遷移率(Ms)。
M 蛋白質(zhì)從原點遷移的距離
從原點到參考點的距離 .
以值為橫坐標，標準蛋白質(zhì)分子量為縱坐標，在半對數(shù)坐標紙上制作標準曲線。
未知樣品分子量的測定:測定出未知蛋白質(zhì)的相對遷移率，利用標準曲線便可計 算出分子量。